產(chǎn)品介紹
卡那霉素（Kanamycin）是一種氨基糖苷類抗生素，其工作原理是與細(xì)菌的30S核糖體亞基結(jié)合，導(dǎo)致t-RNA的誤讀，使細(xì)菌無法合成對其生長至關(guān)重要的蛋白質(zhì)，被廣泛地用于生物醫(yī)藥、動物疾病治療和食品行業(yè)。由于卡那霉素在體內(nèi)不代謝，生物制品中卡那霉素殘留對人體具有嚴(yán)重危害，其會導(dǎo)致不同程度的耳毒性、腎毒性以及神經(jīng)毒性等作用。因此，我國及歐美均對卡那霉素在生物制品和動物性食品中的使用和殘留檢測制定了規(guī)范。艾策生物的卡那霉素殘留ELISA檢測試劑盒（AC72829）提供了一種快速、靈敏和可重復(fù)的方法測定樣品中卡那霉素的殘留，適用于基因和細(xì)胞治療質(zhì)粒放行以及相關(guān)生物制品中卡那霉素的殘留檢測。
檢測原理
卡那霉素殘留ELISA檢測試劑盒原理是采用間接競爭一步法。在酶標(biāo)板中加 入標(biāo)準(zhǔn)品（或樣品）、卡那霉素抗體和酶標(biāo)二抗，微孔板上預(yù)包被的抗原與加入的 標(biāo)準(zhǔn)品（或樣品）中的卡那霉素競爭結(jié)合卡那霉素抗體，被捕獲的卡那霉素抗體 結(jié)合酶標(biāo)二抗，通過TMB底物顯色后，加入終止液終止反應(yīng)，用酶標(biāo)儀在450 nm 處測量吸光度（可選：在650 nm處的參考波長）。整體吸光值與標(biāo)準(zhǔn)品（或樣品）中 卡那霉素的含量成負(fù)相關(guān)，根據(jù)卡那霉素標(biāo)準(zhǔn)曲線對樣品中卡那霉素含量進(jìn)行 精確定量。

Capture Plate：96孔微孔板（8孔×12條），板內(nèi)配置12條，板用干燥劑密封 在鋁箔袋中。
Anti-Kanamycin Antibody：使用前用1×樣品稀釋緩沖液溶解重新配制，溶 解后的抗體在2°C-8°C保存長達(dá)2周，若要長期儲存，請在-20°C或以下的條件中 儲存，避免反復(fù)凍融。

試劑盒未提供的材料與設(shè)備
（1）能夠檢測450 nm吸光度的酶標(biāo)儀，參考波長650 nm
（2）渦旋振蕩器、微孔板振蕩器
（3）離心機(jī)
（4）移液器、槍頭、加樣槽等
（5）準(zhǔn)備試劑用的試管、離心管、量筒等
（6）去離子水或蒸餾水
（7）吸水紙
（8）計時器

儲存條件及有效期
檢測試劑盒2°C-8°C保存，有效期12個月；開封后，有效期1個月。

（1）所有的化學(xué)試劑理應(yīng)被認(rèn)為具有潛在危害，請按照當(dāng)?shù)匾?guī)定進(jìn)行處理。
（2）請避免試劑接觸皮膚和眼睛，如不慎接觸，請立即用大量清水清洗。
（3）試劑盒中的終止液為酸性溶液，在使用終止液時，請佩戴防護(hù)服，及防護(hù)眼 睛、手及面部的設(shè)施。
（4）本試劑盒用于科學(xué)研究，不得用于其它用途。
（5）為保證測試的準(zhǔn)確性，請不要使用其他批號或其他來源的試劑替代本試劑盒 中的試劑，請不要使用超過規(guī)定效期的試劑，可能會引起靈敏度的降低。
（6）在試劑盒的貯存或孵育過程請避免強(qiáng)光照射。
（7）為了避免微生物的污染，以及試劑與樣本間的交叉污染，請使用一次性槍頭。
（8）實驗過程中，不要讓孔板長時間處于干燥狀態(tài)，清洗步驟完成后立即進(jìn)行下 一步。
（9）該試劑盒最佳反應(yīng)溫度為25°C，溫度過高或過低將導(dǎo)致檢測吸光度值和靈敏 度發(fā)生變化，會直接影響檢測結(jié)果。溫育過程中應(yīng)隨時觀察溫箱溫度是否恒定， 及時調(diào)整。

試劑配制
檢測前，請將所有的試劑、樣本平衡到室溫（20°C-25°C）。所有樣品和試劑在 使用前均應(yīng)進(jìn)行渦旋，使用后立即放回冰箱。若濃縮的試劑出現(xiàn)結(jié)晶，37°C水浴， 直至結(jié)晶完全溶解。
● 1×清洗液 用去離子水或蒸餾水稀釋20×清洗液至1×清洗液，備用。
● 1×樣品稀釋緩沖液 用去離子水或蒸餾水稀釋5×樣品稀釋緩沖液至1×樣品稀釋緩沖液，備用。
● Anti-Kanamycin Antibody
用400 μL的1×樣品稀釋緩沖液溶解Anti-Kanamycin Antibody，室溫下放置5 min，此為50×抗體工作液，每次實驗需根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品和待檢樣本的數(shù)量取相 應(yīng)體積用1×樣品稀釋緩沖液按1:50稀釋。
● HRP-Conjugate
根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品和待檢樣本的數(shù)量，用1×樣品稀釋緩沖液按1:100稀釋濃縮的 HRP-Conjugate。
● 標(biāo)準(zhǔn)品配制
取10 μL卡那霉素標(biāo)準(zhǔn)品原液加入990 μL的1×樣品稀釋緩沖液中稀釋100倍， 確保充分混勻，從中取30 μL加入270 μL的1×樣品稀釋緩沖液，此卡那霉素稀釋液 濃度為60.75 ng/mL，記為ST-1。取100 μL的ST-1加入200 μL的1×樣品稀釋緩沖液 混勻，記為ST-2，以此類推，稀釋至ST-6。以1×樣品稀釋緩沖液作為標(biāo)準(zhǔn)曲線的零濃度。

● 樣品準(zhǔn)備
未知的樣品，必須在檢測前進(jìn)行稀釋，以獲得準(zhǔn)確的卡那霉素檢測值，且在試 劑盒的線性范圍內(nèi)。建議對未知樣品進(jìn)行連續(xù)多次的10倍稀釋，以確保至少有一 個稀釋的樣品在標(biāo)準(zhǔn)曲線的范圍內(nèi)。通常需要將樣品稀釋10-10000倍。建議所有 樣品都準(zhǔn)備一式兩份。將結(jié)果乘以稀釋系數(shù)，確定原始樣品中的卡那霉素濃度值。

（1）按試劑配制步驟制備好卡那霉素標(biāo)準(zhǔn)品和樣品。將不需要的板條拆卸下來， 放回鋁箔袋中重新封好封口，保存于2°C-8°C。
（2）標(biāo)準(zhǔn)品/樣品、卡那霉素抗體和酶標(biāo)二抗孵育：在相應(yīng)孔中加入50 μL標(biāo)準(zhǔn)品 （ST-1~ST-7）/樣品，50 μL的1×Anti-Kanamycin Antibody，50 μL 的HRP-Conjugate，振蕩混勻后，用封板膜覆蓋平板，25℃避光孵育30 min。
（3）洗板：取下封板膜，棄掉孔板中液體，每孔加入250 μL的1×清洗液，充分洗滌 4次，每次浸泡30 s，在清洗步驟后將倒置的平板放在吸水紙上拍干，為了保證理 想的實驗性能，需盡量去除殘留液體。
（4）顯色：每孔加入100 μL顯色液，輕輕振蕩混勻，25℃避光孵育15 min（在第一 孔加入顯色液后開始計時）。 （5）檢測：每孔加入100 μL終止液，輕輕振蕩混勻，立即使用酶標(biāo)儀進(jìn)行雙波長檢 測，測定450 nm最大吸收波長和650 nm參考波長下的OD值。校準(zhǔn)后的OD值為 450 nm的測定值減去650 nm的測定值（僅使用450 nm測定會導(dǎo)致OD值偏高， 并且準(zhǔn)確度降低）。

數(shù)據(jù)處理
結(jié)果判定有兩種方法，粗略判定可用第 1 種方法，定量判定用第 2 種方法。注意樣品吸光值與其所含卡那霉素成負(fù)相關(guān)。
1. 粗略分析
用樣品的平均吸光度值與標(biāo)準(zhǔn)值比較即可得出卡那霉素濃度范圍。例如樣 品的吸光度值為介于2 ng/mL-8 ng/mL所對應(yīng)的吸光度值之間。則樣品的濃度范 圍是2 ng/mL-8 ng/mL ，再乘以其對應(yīng)的稀釋倍數(shù)，即可得出樣品中卡那霉素的 實際濃度。
2. 定量分析
（1）百分吸光率的計算，標(biāo)準(zhǔn)品或樣品的百分吸光率等于標(biāo)準(zhǔn)品或樣品溶液 的平均吸光度值(B)除以0值溶液的平均吸光度值(B₀ )，即：
百分吸光度值（%）=B/B₀ ×100%
B—標(biāo)準(zhǔn)溶液或樣品溶液的平均吸光度值
B₀ —0 值溶液的平均吸光度值
（2）標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制與計算
以卡那霉素標(biāo)準(zhǔn)品濃度（ng/mL）作為橫坐標(biāo)，以標(biāo)準(zhǔn)品的的百分吸光度值 作為縱坐標(biāo)，利用繪圖和統(tǒng)計學(xué)等軟件，采用四參數(shù)邏輯曲線擬合程序，通過標(biāo) 準(zhǔn)曲線的各個點計算出最佳擬合的線性關(guān)系。將樣品的百分吸光度值代入標(biāo)準(zhǔn) 曲線中，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出樣品所對應(yīng)的濃度，乘以其對應(yīng)的稀釋倍數(shù)即為樣品 中卡那霉素實際濃度。

產(chǎn)品數(shù)據(jù)展示
1. 標(biāo)曲數(shù)據(jù) 數(shù)據(jù)擬合繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，生成的標(biāo)準(zhǔn)曲線用于實驗數(shù)據(jù)分析。

2. 線性范圍
試劑盒的線性范圍為0.25 ng/mL-60.75 ng/mL。
3. 精密度
使用試劑盒，分別對卡那霉素高、中、低3個濃度的樣本進(jìn)行測試，每個樣本 重復(fù)檢測5次，每個樣本計算5次測量濃度結(jié)果的平均值，計算變異系數(shù)(CV)。根 據(jù)性能評估結(jié)果，所測結(jié)果CV(%)均低于10%，表明試劑盒精密度良好。

4. 準(zhǔn)確性
在標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性范圍內(nèi)，制備高、中、低3個濃度點的卡那霉素質(zhì)控樣品進(jìn) 行測定，分析質(zhì)控樣品檢測濃度相對偏差和回收率。質(zhì)控樣品檢測濃度均值相對 偏差低于20%，質(zhì)控樣品回收率在80% -120%之間。

5. 交叉反應(yīng) 使用試劑盒，評估交叉反應(yīng)物四環(huán)素、硫酸鏈霉素、氨芐青霉素及氯霉素對 體系的干擾，在基質(zhì)中分別添加濃度0.5 μg/mL的四種交叉反應(yīng)物，交叉反應(yīng)率 均小于0.1%。