產(chǎn)品介紹
慢病毒(Lentivirus)載體是在HIV-1(人類免疫缺陷I型病毒)基礎(chǔ)上發(fā)展的基 因治療載體，可以將外源基因穩(wěn)定、有效整合到宿主染色體上，并且持久表達，產(chǎn) 生的免疫反應小。
慢病毒生產(chǎn)后的滴度檢測對其后續(xù)應用至關(guān)重要。p24蛋白含量代表著慢病 毒的顆粒數(shù)，因此通過ELISA檢測p24蛋白含量是常用的慢病毒物理滴度檢測方 法。艾策生物的慢病毒滴度檢測試劑盒（AC72816）利用ELISA方法精確定量慢病 毒樣本中的HIV-1 p24核心蛋白濃度以準確測定慢病毒樣品的滴度。

檢測原理
慢病毒滴度ELISA檢測試劑盒原理是基于“三明治”夾心ELISA法（圖1）。將慢 病毒裂解樣本添加至捕獲板上，樣本中的p24蛋白可以被包被在捕獲板上的抗 p24重組抗體捕獲。捕獲的p24蛋白與另一個生物素偶聯(lián)的抗p24重組抗體結(jié)合。 加入鏈霉親和素-辣根過氧化物酶偶聯(lián)物(Streptavidin-HRP)，與生物素偶聯(lián)的 抗p24的重組抗體發(fā)生反應。加入顯色液反應后，加入終止溶液終止反應，整體顏 色強度與特異性結(jié)合的p24蛋白含量成正相關(guān)。用酶標儀在450 nm處測量吸光 度（可選：在650 nm處的參考波長）。根據(jù)p24蛋白標準曲線對病毒裂解液樣品中 p24含量進行精確定量，最后通過p24含量推算出慢病毒的滴度。

Capture Plate：
96孔微孔板（8孔×12條），板內(nèi)配置12條，板用干燥劑密封在 鋁箔袋中。
p24 Control /Biotinylated Anti-p24 Antibody：
使用前用1×樣品稀釋緩沖 液溶解重新配制，溶解后的生物素化抗體在2°C-8°C保存長達2周，若要長期儲存， 請在-20°C或以下的條件中儲存，避免反復凍融。

試劑盒未提供的材料與設(shè)備
（1）能夠檢測450 nm吸光度的酶標儀，參考波長640 nm
（2）渦旋振蕩器、微孔板振蕩器
（3）離心機
（4）移液器、槍頭、加樣槽等
（5）準備試劑用的試管、離心管、量筒等
（6）去離子水或蒸餾水
（7）吸水紙
（8）計時器
（9）PBS

儲存條件及有效期
檢測試劑盒2°C-8°C保存，有效期12個月；開封后，有效期1個月。

（1）所有的化學試劑理應被認為具有潛在危害，請按照當?shù)匾?guī)定進行處理。
（2）所有使用本試劑盒的人員必須完成適當?shù)纳锇踩嘤?，操作時請佩戴合適 的防護設(shè)施，例如白大衣、乳膠手套、安全眼鏡等。
（3）請避免試劑接觸皮膚和眼睛，如不慎接觸，請立即用大量清水清洗。
（4）試劑盒中的終止液為酸性溶液，在使用終止液時，請佩戴防護服，及防護眼 鏡、手及面部的設(shè)施。
（5）本試劑盒僅用于科學研究，不得用于其它用途。
（6）如果包裝或內(nèi)容有任何可見損壞，不要使用套件。
（7）為保證測試的準確性，請不要使用其他批號或其他來源的試劑替代本試劑盒 中的試劑。
（8）請不要使用超過規(guī)定效期的試劑。
（9）在試劑盒的貯存或孵育過程中請避免強光照射。
（10）試劑的準備必須使用蒸餾水或去離子水。
（11）為了避免微生物的污染，以及試劑與樣本間的交叉污染，請使用一次性槍頭。
（12）濃縮洗液在4°C時會有結(jié)晶析出屬于正常現(xiàn)象，恢復室溫后混勻即可使用。
（13）檢測前，所有試劑必須平衡至室溫（20°C-25°C）。一次只取適量的試劑，不要 將未使用過的試劑放回小瓶中，避免發(fā)生試劑污染。
（14）實驗過程中，不要讓孔板長時間處于干燥狀態(tài)，清洗步驟完成后立即進行下一步。

試劑配制
檢測前，請將所有的試劑、樣本平衡到室溫（20°C-25°C），使用后立即放回冰 箱。若濃縮的試劑出現(xiàn)結(jié)晶，37°C水浴，直至結(jié)晶完全溶解。 
● 1×清洗液
用去離子水或蒸餾水稀釋20×清洗液至1×清洗液，備用。
●1×樣品稀釋緩沖液
用去離子水或蒸餾水稀釋5×樣品稀釋緩沖液至1×樣品稀釋緩沖液，備用。
● Biotinylated Anti-p24 Antibody
用250 μL的1×樣品稀釋緩沖液溶解Biotinylated Anti-p24 Antibody，室溫下放置5 min，根據(jù)標準品和待檢樣本的數(shù)量，用1×樣品稀釋緩沖液按1:50稀 釋Biotinylated Anti-p24 Antibody。
● Streptavidin-HRP
根據(jù)標準品和待檢樣本的數(shù)量，用1×樣品稀釋緩沖液按 1:1000稀釋濃縮 的Streptavidin-HRP。
● 標準品配制
用1.25 mL的1×樣品稀釋緩沖液溶解p24 Control，室溫下放置5 min，根據(jù)標準品的數(shù)量，用1×樣品稀釋緩沖液按 1:100稀釋p24Control，確保充分混勻，再從中取60 μL加入540 μL 的1×樣品稀釋緩沖液，此p24稀釋液濃度為800 pg/mL， 記為ST-1。再取300 μL ST-1加入300 μL的1×樣品稀釋緩沖液混勻，記為ST-2，以 此類推，稀釋至ST-7。以1×樣品稀釋緩沖液作為標準曲線的零濃度。

● 慢病毒樣品預處理
將未知滴度的慢病毒樣品用1×PBS進行梯度稀釋，取150 μL各個稀釋梯度 的樣品加入150 μL Lysing Buffer，混勻反應3 min，將混合液稀釋1000倍以制得 檢測用樣品。建議所有樣品都準備一式兩份。將結(jié)果乘以稀釋系數(shù)，確定原始樣 品中的p24濃度值以計算慢病毒滴度。

ELISA操作流程
（1）按試劑配制步驟制備好p24標準品和樣品。將不需要的板條拆卸下來，放回鋁箔袋中重新封好封口。 
（2）標準品與樣品孵育：在相應孔中加入100 μL的待測樣品、標曲樣品（ST-1~ST-8）， 用封板膜覆蓋平板，在37°C下孵育60 min。
（3）洗板：取下封板膜，棄掉孔板中液體，每孔加入250 μL的1×清洗液，充分洗滌 4次，每次浸泡30 s，在清洗步驟后將倒置的平板放在吸水紙上拍干，為了保證理 想的實驗性能，需盡量去除殘留液體。
（4）生物素標記抗體孵育：在所有檢測孔中加入100 μL稀釋的Biotinylated  Anti-p24 Antibody（參見試劑配制），封板膜封板，在37°C下孵育60 min。
（5）洗板：重復步驟（3）。
（6）酶偶聯(lián)鏈霉親和素孵育：在所有檢測孔中加入100 μL的Streptavidin-HRP （參見試劑配制），封板膜封板，過程避光，在37°C下避光孵育60min。
（7）洗板：重復步驟（3）。
（8）顯色：每孔加入100 μL顯色液，輕輕振蕩混勻，避光，室溫孵育15 min（在第一 孔加入顯色液后開始計時）。 （9）檢測：每孔加入100 μL終止液，輕輕振蕩混勻，立即使用酶標儀進行雙波長檢 測，測定450 nm最大吸收波長和650 nm參考波長下的OD值。校準后的OD值為450 nm的測定值減去650 nm的測定值。僅使用450 nm測定會導致OD值偏高， 并且準確度降低。

數(shù)據(jù)處理
1. 制作標準曲線
以p24標準品濃度（pg/mL）作為橫坐標，相應的吸光度作為縱坐標，若設(shè)有 復孔，則取其平均值。利用繪圖和統(tǒng)計學等軟件，采用四參數(shù)邏輯曲線擬合程序， 通過標準曲線的各個點計算出最佳擬合的線性關(guān)系。
2. 樣品p24濃度計算
將樣品的OD值代入標準曲線的擬合方程，計算樣品p24濃度，所得的值乘以 稀釋倍數(shù)，即樣品的實際p24濃度（pg/mL）。該試劑盒的稀釋范圍是定量的，為了 獲得最高的精確度，未知樣品的OD值需稀釋至推薦的定量范圍內(nèi)。
3. 樣品慢病毒滴度計算
一個慢病毒顆粒（Lentiviral Particle, LP）中約有2000個p24蛋白分子，則一 個LP中p24的含量為：
2000×24×10³ /(6×10²³) g of p24=8×10^-5 pg
或者說 800 pg p24所代表的LP數(shù)目為
800pg/8×10^-5pg =1×10⁷ LPs 正常情況下，每100-1000 LPs中會有1個具有感染活性的病毒載體，即1 TU （Transducing Unit），那么80 ng/mL800 ng/mL的p24濃度對應的滴度為：
80 ng/mL-800 ng/mL p24 = 1×10^9-10 LPs/mL ≈ 1 ×10⁷ TU/mL

產(chǎn)品數(shù)據(jù)展示
1. 標曲數(shù)據(jù)
數(shù)據(jù)擬合繪制標準曲線，生成的標準曲線用于實驗數(shù)據(jù)分析。

2. 線性范圍
試劑盒的線性范圍為12.5pg/mL-800 pg/mL。
3. 加樣回收率
使用試劑盒，在Expi293F細胞上清中檢測三個不同p24濃度分析樣本的加樣 回收率，結(jié)果顯示加樣回收率均在80%-120%之間，表明Expi293F細胞上清并不 影響慢病毒滴度的檢測。

4 精密度
使用試劑盒，分別對p24高、中、低3個濃度的樣本進行測試，每個樣本重復檢 測10次，每個樣本計算10次測量濃度結(jié)果的平均值，計算變異系數(shù)(CV)。根據(jù)性 能評估結(jié)果，所測結(jié)果CV（%）均低于10%，表明試劑盒精密度良好。